讲解下噻唑蓝标准品应用中具体的实验步骤
更新时间：2022-10-21 点击次数：392次
噻唑蓝标准品MTT主要有两个用途
1.药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;
2.细胞增殖及细胞活性测定。
噻唑蓝标准品实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2:培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
注意事项
1.选择适当的细胞接种浓度，保证细胞培养结束时浓度不至于过满。
2.种板技术：均匀。
3.实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。
调零孔：培养基、MTT、DMSO。（无细胞）
溶媒孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、溶酶。
加药孔：培养液、MTT、DMSO、细胞、不同浓度的药物。
（一般5-7个梯度，设3-5个复孔）
4.避免血清干扰：一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。
5.边缘效应：周边孔加入PBS。
6.MTT的配置：MTT0.5克，溶于100ml的磷酸缓冲液。4℃下避光保存2周。
7.孔板的重复利用（1.做完MTT后用大水流尽量将板冲净，然后用洗衣粉水泡几个小时（小心让洗衣粉先化开）。2.用自来水冲净洗衣粉水，倒扣晾干.3.重铬酸钾加浓硫酸配成的酸液中浸泡过夜泡洗液（六小时以上即可）后自来水洗净（20次左右）每个孔都要处理4.用去离子水冲洗3遍，双蒸水冲洗3遍，烤干5.超净台中紫外线照射2个小时左右，就可以用了，不可以高压。或泡酸过夜，dd水冲洗干净，烘干或者晾干后紫外照射30min以上即可使用。
8.MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
9.在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT吸光度在0-0.7范围内。
10.MTT有致癌性，用的时候小心,有条件带那种透明的簿膜手套。
11.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以操作台上的照明灯关掉。
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